(2) 血清都是批量生產，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實驗的標準化和連續(xù)性受到限制；

平衡鹽溶液（balanced salt solution，BSS ）簡稱鹽溶液，集緩沖液的緩沖能力、生理鹽水的等滲性以及培養(yǎng)液的營養(yǎng)供應特點于一體，兼具維持滲透壓、緩沖和調節(jié)溶液的酸堿度、同時供給細胞生存所必需的能量和無機離子成分的作用。各種BSS的緩沖系統(tǒng)有所不同，其中以Hank’s液和Earle’s液為例，它們主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Earle’s (2.2 g/L)中比在Hank’s (0.35 g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的pH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hank’s液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Earle’s液，。如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hank’s液就可以了。

一些BSS含有的Ca2+、Mg2+是細胞膜的重要組成成分，同時參與許多重要的細胞功能活動。但它們有使細胞凝集的作用，在配制分散細胞的消化液和特殊用途的細胞洗滌時，宜采用Ca2+、Mg2+含量較低的Dulbecco液或無Ca2+、Mg2+的D-Hanks液，或者PBS液。

2.3基礎培養(yǎng)基

2.3.1 概述

基礎細胞培養(yǎng)基主要包括199、MEM、RPMI-1640、DMEM 、DMEM/F12等。主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質。人工合成培養(yǎng)基使用時還需添加一定量的血清使細胞生長和繁殖

2.3.2 組成及作用

氨基酸：組成蛋白質的基本單位。不同的細胞對氨基酸的需求各異，但幾種必需氨基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，如組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等。其余非必需氨基酸，細胞可以自己合成，或通過轉氨作用由其他物質轉化而來。絕大部分細胞對谷氨酰胺有較高的要求，因為谷氨酰胺是作為能源

及碳源物質同時被細胞利用，是是細胞合成核酸和蛋白質必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡，所以各種培養(yǎng)液中都含有較多的谷氨酰胺。細胞所能利用的氨基酸是L型同分異構體，D型氨基酸不能被利用。

維生素：維持細胞生長的一種生物活性物質，對細胞代謝有重大作用。它們在細胞中大多形成酶的輔基或輔酶，沒有它們，酶便沒有活性，代謝活動將無法進行。維生素分為水溶和脂溶兩大類的培養(yǎng)液中直接采用ATP和fu酶A。

葡萄糖：大部分培養(yǎng)基都以葡萄糖作為能量來源之一。

無機鹽：維持培養(yǎng)基滲透壓平衡，參與細胞的代謝活動。主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+等。Na+是細胞外液中最主要的陽離子，對維持滲透壓的恒定有決定性的作用。K+主要分布在細胞內液，細胞內K+對于激活某些酶是必需的，并在調節(jié)細胞內環(huán)境的酸堿平衡上也有極重要意義。Ca2+在細胞外液中的作用是將組織內部細胞之間相互粘著，在細胞內參與許多重要的細胞生理活動，如傳導、參與肌肉細胞收縮等。在懸浮培養(yǎng)時，為了減少細胞的聚集和附著，要減少Ca2+的濃度。

Mg2+是構成細胞間質的重要成分，對于細胞間相互穩(wěn)定結合有很重要的意義。磷的化合物對細胞物質代謝和生理功能調控有重要作用。

其他成分：肽、核苷、嘌呤等?？蓭椭毎目寺』囵B(yǎng)及維持某些特殊細胞系的生長。

2.4 低血清細胞培養(yǎng)基

2.4.1 概述

營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基是維持細胞活性及高密度生長的基礎，營養(yǎng)缺乏容易引起細胞凋亡，新生牛血清中所含大部分營養(yǎng)成分可以通過化學成分明確的營養(yǎng)物質如氨基酸維生素等成分組合取代。低血清培養(yǎng)基營養(yǎng)成分大優(yōu)于基礎培養(yǎng)基，僅需添加1％～5％新生牛血清，而對細胞生長、增殖、形態(tài)、活性和功能沒有影響甚至有所改善。

在國外低血清培養(yǎng)基早已有之，如Gibco等。但是他們的低血清培養(yǎng)基是在基礎培養(yǎng)基中選擇性的加入重組胰島素（recombinant insulin）、人源轉鐵蛋白（human (holo) tran- sferrin）以及牛血清白蛋白等，有些還包含一些生長因子，這些重組蛋白和動物來源成分對生物制品的安全性有很大影響。成本低。

三、細胞培養(yǎng)基的質量標準和檢測方法

3.1細胞培養(yǎng)基的質量標準

3.2細胞培養(yǎng)基的檢測方法

3.2.1 澄清度

水是細胞培養(yǎng)基的溶劑。細胞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分只有溶解于水才能被細胞吸收攝取，細胞才能生長增殖，因此細胞培養(yǎng)基是否溶解以及培養(yǎng)液是否透明澄清直接影響培養(yǎng)基使用。該項目是通過對水溶解后的細胞培養(yǎng)基的澄清度檢查，判斷細胞培養(yǎng)基的澄清度。 按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄Ⅸ B進行。

3.2.2 pH 值

哺乳類動物細胞生長需要合適的酸堿度，pH過高或者過低都會導致細胞死亡。pH值的測定也可以檢查細胞培養(yǎng)基的批間差。清大天一標準規(guī)定取規(guī)定量供試品，用注射用水（水溫20℃-30℃）溶解至1L，加入規(guī)定量碳酸氫鈉到上述溶液中，用與細胞培養(yǎng)基溶液pH值相近的兩點標準緩沖液校準后的酸度計進行測定。按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄Ⅵ H進行；加入規(guī)定量的碳酸氫鈉到上述溶液中，按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄Ⅵ H進行

3.2.3 干燥減量的質量分數

細胞培養(yǎng)基具有吸濕性，在空氣中放置水分會很快升高，干燥減量的質量分數表示產品中含濕量。細胞培養(yǎng)基是有菌制劑，其豐富的營養(yǎng)成分有利于微生物生長，控制細胞培養(yǎng)基中的水分可以防止微生物的繁殖，保持細胞培養(yǎng)基的養(yǎng)分。按中華人民共和國藥典2005 年版二部附錄Ⅷ L 干燥失重測定法進行。

3.2.4 滲透壓

溶劑通過半透膜由低濃度向高濃度溶液擴散的現(xiàn)象稱為滲透，阻止?jié)B透所需施加的壓力，稱為滲透壓。細胞必須生活在等滲環(huán)境中，動物細胞借助K＋、Na＋維持滲透平衡。大多數細胞對滲透壓有一定的耐受性。但是培養(yǎng)液滲透壓過高容易使細胞脫水wei縮，培養(yǎng)液滲透壓過低容易使細胞膨脹破裂，因此要控制培養(yǎng)基的滲透壓范圍。按中華人民共和國藥典2005 年版二部附錄Ⅸ G 滲透壓摩爾濃度測定法進行。

3.2.5 細菌內毒素

細菌內毒素是許多病原性細菌所產生的毒素。它的特殊性在于不是細菌或細菌的代謝產物，而是細菌死亡或解體后才釋放出來的一種具有生物活性的物質。培養(yǎng)基細菌內毒素過高，對生物制品疫苗（如狂犬、乙肝疫苗）、基因工程藥品等注射用的藥品都需要檢查細菌內毒素。 因此本項目的檢驗符合生物制品質量控制要求。常規(guī)細胞培養(yǎng)基的細菌內毒素標準定為＜10 EU/ml。稱取本品規(guī)定量（見表4-12）的1/100，加入細菌內毒素檢查用水10 mL溶解，吸取該溶液0.1 mL加細菌內毒素檢查用水3.9 mL，混勻即得試樣。按中華人民共和國藥典2005 年版二部附錄Ⅺ E 細菌內毒素檢查法中的凝膠法進行。

3.2.6 微生物限度

細胞培養(yǎng)基不是無菌產品，其中的微生物在一定條件下會吸收細胞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質滋生繁殖，導致細胞培養(yǎng)基變質失效。控制細胞培養(yǎng)基中細菌和霉菌，是延長細胞培養(yǎng)基有效期的方法之一。清大天一在參考《中華人民共和國藥典》2005版二部附錄第100頁的口服給藥制劑的微生物限度標準，并嚴于該標準，規(guī)定細胞培養(yǎng)基產品的細菌數每1g不得超過200個，霉菌數每1g不得超過50個。

稱取樣品1 g，加入無菌純化水10 mL溶解，混勻即得試樣。按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄Ⅺ J 微生物限度檢查法進行，檢查項目為細菌數、霉菌數。檢查法采用平皿法。

3.2.7 細胞生長試驗

這是一個性能特性表述的要求。細胞培養(yǎng)基的功能就是培養(yǎng)哺乳類動物細胞，因此經過細胞培養(yǎng)效果的檢驗是產品質量優(yōu)劣的直觀表述，這也是很多生物制藥用戶要求的一項指標。目前國內尚無細胞培養(yǎng)和計數的法定方法，可參考《體外培養(yǎng)的原理與技術》中細胞計數法中論述的內容給出。按產品說明書配制培養(yǎng)液進行細胞培養(yǎng)，前四天用含10％小牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)并計數，檢查細胞培養(yǎng)基是否有促生長的能力。后三天用不含小牛血清的培養(yǎng)液維持培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)并計數，檢查細胞培養(yǎng)基中是否有不利細胞生長的毒素。本試驗用細胞為VERO細胞。

四、細胞培養(yǎng)基的使用方法

細胞培養(yǎng)基的種類繁多，細胞培養(yǎng)方式也較多，如何正確地使用培養(yǎng)基及很大程度地保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)以維持細胞的生長，對每個培養(yǎng)者都很重要。培養(yǎng)基的使用依不同的培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)方式、細胞種類的不同而存在差異。

4.1 細胞培養(yǎng)液的構成

細胞培養(yǎng)液指細胞生長的液體環(huán)境，一般指培養(yǎng)液，添加了血清、水解乳蛋白、各種添加劑等可以直接使用的培養(yǎng)液。

4.1.1 細胞培養(yǎng)基&血清模式

血清對于在傳統(tǒng)培養(yǎng)基配方中生長和增殖的大多數細胞系來說是需要的，因為大多數單獨的培養(yǎng)基并不能提供細胞生長所需要的全部營養(yǎng)，如MEM培養(yǎng)基，較為常用的量為5％～10％的比例，而特殊的低血清培養(yǎng)基血清量可降至3％左右，細胞的形態(tài)和功能不受影響。

4.1.2 細胞培養(yǎng)基&乳歐液模式

化學合成培養(yǎng)基現(xiàn)雖已大規(guī)模使用，但在某些培養(yǎng)領域水解乳蛋白仍在使用，以補充培養(yǎng)液中缺乏的氨基酸、小肽物質。較為常用的方式是用漢氏（Hanks’ BSS）或歐式(Earle’s BSS)平衡液溶解水解乳蛋白（一般為5‰濃度），即成乳漢（歐）液，再與化學合成培養(yǎng)基（一般為MEM）按比例混合使用（如1：1）。

4.1.3 細胞培養(yǎng)基&各類添加劑（生長因子等）模式

成分復雜的培養(yǎng)基還含有許多化合物，包括蛋白質、多肽、核苷、檸檬酸循環(huán)的中間產物、丙酮酸及脂類等。已發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)基中的血清濃度減少時，這些成分都是必需的。既使在使用血清的情況下，這些成分也可幫助細胞的克隆化培養(yǎng)及維持某些特殊細胞系的生長。激素和生長因子在大多數常規(guī)培養(yǎng)基的配方中都沒有注明，但在無血清培養(yǎng)基中通常要加入它們，用其來代替血清中的激素能增加多種不同類型細胞的貼瓶率；生長因子包括FGF家族、EGF、PDGF、IGF－1和IGF－2及白介素等，生長因子和細胞因子有著廣泛的特異性，一般與激素或其它物質起相互協(xié)同或加成作用。另一種常見的添加物就是血清替代物，目前已有許多可替代傳統(tǒng)培養(yǎng)液中血清成分的商業(yè)產品，其穩(wěn)定性較好，但批次間仍有差別，產品的成分也不很確定。

4.2細胞培養(yǎng)基配制

4.2.1 干粉培養(yǎng)基原倍液的配制

1）配制過濾除菌的細胞培養(yǎng)基

(1) 閱讀培養(yǎng)基使用說明，確定需要添加何種添加劑（如NaHCO3、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等）。

(2) 根據所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）將袋內殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95％，輕微攪拌溶解。

(3) 加入規(guī)定量的碳酸氫鈉及所要添加的物質。

(4) 輕微攪拌溶解，加注射用水至規(guī)定體積。

(5) 用1 mol / L 氫氧化鈉溶液或 1 mol / L 鹽酸溶液調pH至所需值。

(6) 用0.22 μm濾膜正壓過濾除菌。

(7) 溶液應在2℃－8℃下避光保存。

具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說明書。

2）配制可高壓滅菌細胞培養(yǎng)基

(1) 根據所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）將袋內殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95％，輕微攪拌溶解

(2) 在121℃、15psi下滅菌15分鐘。

(3) 待溶液冷卻至室溫，加入無菌0.2 mol / L L－谷氨酰胺溶液規(guī)定體積、無菌7.5％（w/v）碳酸氫鈉溶液規(guī)定體積，加注射用水（20℃～30℃）至規(guī)定體積，混勻。

(4) 如果必要，用1 mol / L 氫氧化鈉溶液或 1 mol / L 鹽酸溶液調pH至所需值。

(5) 溶液應在2℃－8℃下避光保存。

具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說明書

4.2.2 注意事項

1） 細胞培養(yǎng)用水一般為三蒸水（經石英蒸餾器蒸餾）或超純水，醫(yī)藥生產上一般為注射用水。

2） 建議盡量選擇與所用量相匹配的包裝一次使用，因為包裝一旦打開，組分可能會變質或因受潮而結團。

3） 溶解干粉培養(yǎng)基時先加入終體積90％－95％的培養(yǎng)用水，添加劑加完后再補足。

4） 如需添加的組分較多時，某一組分溶解后，再添加另一組分。

5） 待培養(yǎng)基溶解后再加入碳酸氫鈉，以免產生沉淀。

6） 所有成分溶解后，培養(yǎng)基應立即過濾或高壓除菌，以免產生沉淀或有微生物污染。

7） 在過濾除菌時，一般情況下應調pH比所需值低0.1～0.2個單位，因過濾除菌后，pH值會升高約0.2。

8） 在細胞培養(yǎng)過程中，建議不加或加少量的抗生素，如血清的濃度較低則所加抗生素的量也要相應降低一些。

4.3.1 高壓滅菌

某些培養(yǎng)基（如MEM）可進行高壓滅菌，例如清大天一的MEM培養(yǎng)基中的MD605、MD609等。其中不含有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，可在高壓滅菌后加入。另外可高壓的谷氨酸鹽（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）可代替L-谷氨酰胺

為保證高壓滅菌的效果，滅菌設備的驗證很關鍵，可高壓滅菌的培養(yǎng)基在121℃、15psi，15分鐘的條件下可達到滅菌效果及營養(yǎng)成分的最小損失，因此不需將滅菌時間延長。

4.3.2 過濾滅菌

大多數培養(yǎng)基采用0.1～0.2 μm孔徑的微孔濾膜進行過濾滅菌，并且已成為培養(yǎng)基除菌的發(fā)展方向，它可低限度地減少培養(yǎng)基的營養(yǎng)損失。

4.4 細胞培養(yǎng)液的儲存

細胞培養(yǎng)液的儲存條件一般為2－8℃、密閉、避光保存，但要注意如下幾點：

1） 過濾后的培養(yǎng)液，即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培養(yǎng)液要盡快使用，一般在2－3周內使用完。培養(yǎng)液中的L-谷氨酰胺是不穩(wěn)定的，不同溫度L－谷氨酰胺的降解。

2） 滅菌后的未加L-谷氨酰胺等添加劑的培養(yǎng)基溶液，一般可在4℃保存6～9個月，也可冷凍保存，用時解凍

3） 高壓除菌后的培養(yǎng)基應置4℃保存，不能因為其可耐受高溫而忽略儲存溫度。